Крытычны крок пасля сінтэзу пептыдаў: канцэнтрацыя, выдаленне растваральніка і рэгенерацыя растваральніка

У апошнія гады значна паскорыўся развіццё і індустрыялізацыя пептыдных лекаў, функцыянальных пептыдаў, актыўных касметычных пептыдаў і пептыдных прамежкавых злучэнняў. У параўнанні з традыцыйнымі малымі малекуламі пептыды, як правіла, маюць больш складаную структуру, большую малекулярную масу і большую чулівасць да цяпла. Падчас пераходу ад лабараторных даследаванняў да пілатных і прамысловых маштабаў вытворчасці пептыдаў ніжэйшыя працэсы становяцца ўсё больш важнымі.

Сінтэз пептыдаў — гэта толькі першы этап. Ачышчэнне, канцэнтрацыя, выдаленне растваральніка, рэгенерацыя растваральніка і сушка могуць напрамую ўплываць на якасць прадукцыі, ураджайнасць, эксплуатацыйную эфектыўнасць і выдаткі на вытворчасць.

 

Для пептыдаў, атрыманых метадам сінтэзу на цвёрдай фазе (SPPS), асабліва пасля прыгатавальнай чысткі метадам ВЭЖХ, часта ўтвараюцца вялікія аб’ёмы фракцый з нізкай канцэнтрацыяй. Таму эфектыўнае выдаленне ацэтанітрылу, вады і іншых растваральнікаў пры мінімальным цяплавым уздзеянні з’яўляецца ключавай праблемай пры маштабаванні вытворчасці пептыдаў.

1. Што робіць апрацоўку пептыдаў на стадыі паслясінтэзу складанай?

Тыпавы працэс SPPS уключае дэпратэктаванне, купляванне, прамыванне, кліўаж, фільтраванне, апрацоўку сырага прадукту, чыстку метадам ВЭЖХ, канцэнтраванне і ліафілізацыю.

Аднак пасля прыгатавальнай ВЭЖХ зборныя фракцыі — гэта не проста «растворы пептыдаў». Яны звычайна ўтрымліваюць вялікія колькасці вады і ацэтанітрылу, часам разам з невялікімі колькасцямі кіслых модыфікатараў, пры тым што канцэнтрацыя мэтавага пептыда застаецца адносна нізкай.

Гэта стварае некалькі распаўсюджаных праблем пры апрацоўцы.

Праблема 1: Вялікія аб’ёмы фракцый ВЭЖХ павялічваюць нагрузкі на працэс ліафілізацыі

У падрыхтоўчай ВЭРХ-храматаграфіі звычайна выкарыстоўваюцца вада і ацэтанітрыл у якасці рухомых фаз для градыентнага элюявання. Мэтавы пептыд можа быць зборны ў некалькіх фракцыях, што прыводзіць да вялікага агульнага аб'ёму вадкасці з адносна нізкай канцэнтрацыяй пептыда.

Калі гэтыя фракцыі накіроўваюцца непасрэдна ў ліафілізатар, нагрузкі на замарожванне і сублімацыю значна ўзрастаюць. Гэта можа падоўжыць цыкл ліафілізацыі і заняць каштоўную магутнасць абсталявання.

Практычным рашэннем з'яўляецца ўвядзенне этапу выпарвання ў тонкай плёнцы перад ліафілізацыяй.

Пад вакуумам тэмпература кіпення растваральнікаў зніжаецца. Падача непарыўна размеркавана ў тонкую плёнку сістэмай шчотак, што дазваляе хуткае выпарванне ацэтанітрыла і часткі вады, у той час як пептыд застаецца ў асноўным у сканцэнтраванай вадкай фазе.

Гэта зменшвае аб'ём вадкасці, якая паступае ў ліафілізатар, і пераносіць частку нагрузкі па выдаленню растваральніка на больш эфектыўны этап папярэдняга канцэнтравання.

Выклік 2: Пептыды чулівыя да цяпла

Некаторыя пептыды чулівыя да тэмпературы, pH і ўмоваў акісляння. Пры звычайнай партыённай выпарцы матэрыял можа заставацца ў нагрэтай посудзіне працяглы час.

Па меры павелічэння канцэнтрацыі могуць таксама павялічвацца вязкасць і лакальная канцэнтрацыя. Працяглы нагрев павялічвае рызыку дэградацыі пептыдаў, агрэгацыі, змянення колеру ці страты актыўнасці.

Таму пры канцэнтраванні пептыдаў мэтай з’яўляецца не проста павелічэнне тэмпературы і паскорванне выпарцы. Больш прыдатны падыход — зніжэнне тэмпературы выпарцы пры мінімізацыі часу перабывання.

У выпаральніку з размінальнай плёнкай працэс адбываецца ў вакууме, пры гэтым вадкасная плёнка на нагрэтай паверхні пастаянна абнаўляецца. Гэта паляпшае цеплааддачу і дазваляе летучым растваральнікам хутка выпарвацца ў адносна мяккіх умовах, скарачаючы час перабывання пептыда ў нагрэтай зоне.

Выклік 3: Спажыванне ацэтанітрылу стварае моцную неабходнасць у аднаўленні растваральніка

Ацэтанітрыл шырока выкарыстоўваецца ў якасці арганічнай рухомай фазы ў падрыхтоўчай ВЭЖХ для пептыдаў. Пры павелічэнні маштабаў вытворчасці ад лабараторных да пілатных і прамысловых узроўняў спажыванне ацэтанітрыла можа значна ўзрасці.

Калі ўсе сумесі ацэтанітрыла і вады апрацоўваюцца непасрэдна як адходныя растворы, то спажыванне растваральніка і ціск на сістэму апрацоўкі адходаў павялічваюцца.

Для падыходных працэсаў можна разгледзець камбінаваны маршрут:

Выпарванне з паметным плёнкавым шарам → Кандэнсацыя → Аднаўленне растваральніка → Вакуумная дыстыляцыя

У выпарвальніку з паметным плёнкавым шарам спачатку выдаляюцца летучыя кампаненты, такія як ацэтанітрыл і вада, з раствора, які змяшчае пептыды. Пара затым кандэнсуецца і збіраецца.

Калі патрабуецца больш высокая чысціня ацэтанітрыла, адноўленую сумесь растваральніка можна далей апрацаваць у калоне дыстыляцыі.

Гэтая канфігурацыя захоўвае мэтавы пептыд у бяспечнай адзельнасці ад працяглых умоваў дыстыляцыі, адначасова дазваляючы сістэме дыстыляцыі выконваць тую задачу, для якой яна прызначана лепш за ўсё: падзел і ачышчэнне растваральніка.

Выклік 4: Працэсы з пептыдамі нельга проста скапіяваць, выкарыстоўваючы адзіны набор параметраў

Розныя пептыды могуць істотна адрознівацца па малекулярнай масе, паслядоўнасці, пачатковай канцэнтрацыі, складзе растваральніка, вязкасці, схільнасці да пянення, кrysталізацыі і цеплавой чулівасці.

Таму фіксаваная камбінацыя тэмпературы, вакууму, хуткасці подачы і суадносін канцэнтрацыі не можа быць прымянена да ўсіх сістэм з пептыдамі.

Для матэрыялаў высокай кошту больш надзейны шлях маштабавання такі:

Тэставанне матэрыялу → Праверка параметраў → Пілатнае маштабаванне → Праектаванне вытворчага абсталявання

Тэставанне дазваляе ацаніць такія фактары, як склад подачы, суадносіны ацэтанітрыл/вода, працоўная магутнасць, максімальна дапушчальная тэмпература, мэтавы каэфіцыент канцэнтрацыі, ўзровень вакууму, хуткасць подачы і ўмовы працы шчотак.

Гэта дазваляе вызначыць стабільны рэжым працы перад пераходам на большую сістэму.

2. Падыход YHCHEM да паслепратэінавай апрацоўкі пептыдаў

У тыпічным працэсе атрымання пептыдаў пасля храматаграфіі з выкарыстаннем вадкаснай храматаграфіі высокага ціску ўсталяўваецца выпарвальнік з шчоткавым пакрыццём для апрацоўкі вялікіх аб’ёмаў фракцый з нізкай канцэнтрацыяй.

Асноўная задача — хуткае выдаленне растваральніка і папярэдняе згушчэнне ў вакууме з выкарыстаннем тонкай плёнкі і кароткага часу перабывання, каб знізіць цяплавое ўздзеянне.

Затым скандэнсаваную сумесь ацэтанітрылу і вады можна накіраваць у сістэму дыстыляцыі, калі патрабуецца далейшае чысценьне або рэгенерацыя растваральніка.

Для некаторых спецыяльных сістэм, якія ўтрымліваюць арганічныя кампаненты з высокай тэмпературай кіпення, цеплачулівыя і дастаткова летучыя, малекулярную дыстыляцыю таксама можна разгледзець у адпаведнасці з фізічнымі ўласцівасцямі матэрыялу.

Аднак большасць пептыдаў самі па сабе маюць адносна высокую малекулярную масу і экстрэмальна нізкую летучасць. Таму малекулярную дыстыляцыю, як правіла, не выкарыстоўваюць як асноўны метад прамой чысткі мэтавага пептыду.

Ключавы момант — гэта не проста паслядоўнае злучэнне абстаракцыі на малекулярнай аснове, выпарвання з размазанай плёнкай і абстаракцыйнага абстарактара. Кожная адзінка павінна выконваць задачу сепарацыі, якая найбольш адпавядае яе характарыстыкам.

3. Чаму для канцэнтрацыі пептыдаў выкарыстоўваюць выпарванне з размазанай плёнкай?

Для выдалення растваральніка можна выкарыстоўваць некалькі тыпаў абстаракцыйнага абстарактара, у тым ліку ротацыйныя выпарвальнікі, звычайныя партыяныя вакуумныя выпарвальнікі і выпарвальнікі з размазанай плёнкай.

Ратарныя эўапоратары

Ротацыйныя выпарвальнікі з’яўляюцца гнуткімі і зручнымі для невялікіх лабараторных партый. Аднак пры павелічэнні аб’ёма перапрацоўкі магутнасць партыі, час перапрацоўкі, непарыўнасць працэсу і эфектыўнасць рэкампенсацыі растваральніка могуць стаць абмежавальнымі фактарамі.

Партыяныя вакуумныя выпарвальнікі

Партыянае вакуумнае выпарванне дазваляе апрацоўваць большыя аб’ёмы, але ўвесь аб’ём партыі застаецца ў рэзервуары падчас награвання і канцэнтрацыі. Для цёпла-чулых і высокакаштоўных пептыдных матэрыялаў трэба ўважліва кантраляваць працяглы цяплавы ўздзеянне.

Выпарвальнікі з размазанай плёнкай

У выпарвальнікавым апараты з пляноўкай плёнкай матэрыял наносіцца на паверхню выпарвання ў выглядзе цонкай плёнкі. У спалучэнні з працай у вакууме гэта дазваляе хутка перадаваць цяпло і выпарваць растваральнік.

Асноўныя перавагі для канцэнтрацыі пептыдаў уключаюць:

Выпарванне пры нізкай тэмпературы
Вакуум зніжае тэмпературу кіпення ацэтанітрылу, вады і іншых летучых растваральнікаў, што дазваляе праводзіць канцэнтрацыю ў мяккіх умовах.

Кароткі час працягвання
Матэрыял хутка праходзіць праз зону выпарвання, а не застаецца ў нагрэтай посудзіне на працягу доўгага часу.

Эфектыўная перадача цяпла
Шчотка пастаянна абнаўляе плёнку рэчыва, зменшваючы супраціў перадачы цяпла і павышаючы эфектыўнасць выпарвання.

Непарыўны працэс
Непарыўнае падаванне і адвод рэчыва спрашчаюць інтэграцыю выпарвальнікавага апарата з папярэднімі сістэмамі збору фракцый HPLC і наступнымі стадыямі — кандэнсацыі, рэкампенсацыі растваральніка і лёдзяной сушкі.

Зручнае збора растваральніка
Ацэтанітрыл і вада, якія былі выдалены, могуць быць скандэнсаваныя і збораныя для наступнага падзялення і аднаўлення.

маштабаванне — гэта больш чым проста павелічэнне памераў абсталявання

Пераход ад лабараторных эксперыментаў у грамавай шкале да вытворчасці пептыдаў у кілаграмавай шкале або большай не зводзіцца толькі да павелічэння памеру рэакцыйнай посудзіны.

Сам працэс павінен быць маштабаваны.

Ключавымі параметрамі з’яўляюцца час перабывання, плошча перадачы цяпла, стабільнасць вакууму, магутнасць кандэнсацыі, хуткасць подачы, суадносіны канцэнтрацыі і кантроль канчатковай кропкі.

Ратавальны выпарвальнік можа добра працаваць пры апрацоўцы невялікіх лабараторных партыяў, але калі аб’ём рэчыва павялічваецца да дзесяткаў або сотняў літраў, то час апрацоўкі, цяплавая гісторыя і патрабаванні да аднаўлення растваральніка могуць значна змяніцца.

Для высокакаштоўных пептыдных матэрыялаў абсталяванне трэба праектаваць з уліку патрабаванняў да матэрыялу і працэсу, а не навпакі — прымушаць матэрыял адпавядаць фіксаванай канфігурацыі абсталявання.

YHCHEM засяроджваецца на поўным цыкле распрацоўкі — ад тэставання матэрыялаў і праверкі параметраў працэсу да пілатнага маштабавання і праектавання непарыўна дзейных устаноўкаў. Плошча выпарвання, вакуумная сістэма, магутнасць кандэнсатара, канфігурацыя ўстаноўкі і аўтаматызацыя могуць быць абраныя ў адпаведнасці з рэальными патрабаваннямі працэсу.

5. Прыклад выкарыстання: канцэнтрацыя фракцый чысткі пептыдаў

Кампанія ў Усходняй Кітаі праводзіла маштабаванне працэсу атрымання пептыдаў на аснове сінтэзу на цвёрдай фазе і падрыхтоўчай ВЭРХ-чысткі.

Пры павелічэнні памеру партыі аб'ём фракцый ВЭРХ, якія змяшчаюць пептыды, таксама значна павялічыўся. Гэтыя фракцыі змяшчалі вялікія колькасці вады і ацэтанітрылу, пры гэтым канцэнтрацыя пептыда заставалася адносна нізкай.

Кампанія раней выкарыстоўвала традыцыйнае партыянае выпарванне для папярэдняга канцэнтравання. Аднак з павелічэннем прапускной здольнасці працэс стаў даўжэйшым, цеплавое ўздзеянне павялічылася, а навантажэнне на лёдзяное высушванне ўзрасло. Адноўленая сумесь ацетанітрылу і вады таксама не мела эфектыўнага шляху аднаўлення.

На аснове аналізу матэрыялаў і папярэдніх выпрабаванняў працэсу ў ніжэйшай частцы патоку былі ўнесены карэктыўныя захады:

АВЖХ-пурыфікацыя → Выпарванне з размазванай плёнкай → Канцэнтрат пептыдаў → Лёдзяное высушванне

Падчас выпарвання з размазванай плёнкай вакуум зніжае тэмпературу выпарвання растваральніка. Падача хутка распаўсюджваецца ў тонкую плёнку, што дазваляе выдаліць ацетанітрыл і частку вады ў адносна кароткі час працягвальнасці працэсу, у той час як пептыды застаюцца ў асноўным у канцэнтраванай цяжкай фазе.

Выпараны растваральнік кандэнсуецца і збіраецца. У выпадку неабходнасці можна выкарыстоўваць дадатковую сістэму вакуумнай дыстыляцыі для далейшага падзялення адноўленай сумесі ацетанітрылу і вады.

Гэты працэс пераносіць значную частку абавязкаў па выдаленні растваральніка з лёдзяной сушыльніцы на выпарвальнік з паскрабальнымі плёнкамі, змяншаючы аб'ём вадкасці, якая паступае на этап лёдзяной сушкі, і палепшваючы агульную непарыўнасць працэсу.

Выніковы працэс можна падвесці так:

Выпарванне з паскрабальнымі плёнкамі для канцэнтрацыі пептыдаў пры нізкіх тэмпературах + Рэктыфікацыя для аднаўлення растваральніка + Лёдзяная сушка для атрымання канчатковага прадукту

Кожная асобная аперацыя выконвае асобную функцыю, што дапамагае зменшыць непатрэбнае цяплавое ўздзеянне і забяспечвае практычную аснову для далейшага маштабавання.

Заўвага: Гэты прыклад заснаваны на тыповай сітуацыі апрацоўкі пептыдаў на завяршальным этапу. Фактычная канфігурацыя абсталявання і эксплуатацыйныя параметры павінны вызначацца ў адпаведнасці з складам матэрыялу, магутнасцю апрацоўкі, характарыстыкамі прадукту і эксперыментальнымі вынікамі.