Ключов етап след синтеза на пептиди: концентриране, отстраняване на разтворител и възстановяване на разтворител

През последните години разработката и индустриализацията на пептидни лекарства, функционални пептиди, активни козметични пептиди и пептидни интермедиати се ускориха значително. В сравнение с обичайните малки молекули пептидите обикновено имат по-сложни структури, по-високи молекулни тегла и по-голяма чувствителност към топлина. Когато производството на пептиди преминава от лабораторни изследвания към пилотно и промишлено мащабиране, долното течение на процеса става все по-важно.

Синтезът на пептиди е само първата стъпка. Пуритикация, концентриране, отстраняване на разтворител, възстановяване на разтворител и сушене могат директно да повлияят върху качеството на продукта, добива, експлоатационната ефективност и производствените разходи.

 

За пептидите, получени чрез синтеза на твърда фаза (SPPS), особено след подготовителна ВЕСХ хроматографска пречиствка, често се получават големи обеми фракции с ниска концентрация. Ефективното отстраняване на ацетонитрил, вода и други разтворители при минимизиране на термичното въздействие е затова ключов предизвикателство при мащабирането на производството на пептиди.

1. Какво прави обработката на пептиди след синтеза трудна?

Типичният процес SPPS включва депротекция, свързване, измиване, кливане, филтриране, обработка на суровия продукт, ВЕСХ пречиствка, концентриране и лиофилизация.

След подготовителната ВЕСХ обаче събраните фракции не са просто «разтвори на пептиди». Обикновено те съдържат големи количества вода и ацетонитрил, понякога заедно с малки количества кисели модификатори, докато концентрацията на целевия пептид остава относително ниска.

Това поражда няколко типични предизвикателства при обработката.

Предизвикателство 1: Големите обеми на ВЕСХ фракции увеличават товара върху лиофилизатора

Предварителната ВВЕХ обикновено използва вода и ацетонитрил като подвижни фази за градиентно елуиране. Целевият пептид може да се събира в множество фракции, което води до голям общ обем течност с относително ниска концентрация на пептида.

Ако тези фракции се изпратят направо към лиофилизатор, товарът при замразяване и сублимиране значително нараства. Това може да удължи цикъла на лиофилизиране и да заеме ценна капацитетна мощност на оборудването.

Практично решение е да се въведе стъпка на изпаряване с размазващо устройство преди лиофилизирането.

Под вакуум температурата на кипене на разтворителите намалява. Изходният разтвор се разпределя непрекъснато в тънка пленка чрез системата за размазване, което позволява бързо изпаряване на ацетонитрила и част от водата, докато пептидът остава предимно в концентрираната течна фаза.

Това намалява обема течност, постъпваща в лиофилизатора, и прехвърля част от функцията по отстраняване на разтворителя към по-ефективен етап на предварително концентриране.

Предизвикателство 2: Пептидите са чувствителни към топлина

Някои пептиди са чувствителни към температура, pH и условия на окисление. При конвенционалното партидно изпаряване материала може да остане в загрята съда в продължение на дълъг период.

С увеличаването на концентрацията вискозитетът и локалната концентрация също могат да нараснат. Продължителното загряване може да увеличи риска от деградация, агрегация, промяна на цвета или загуба на активност на пептидите.

Целта при концентриране на пептиди следователно не е просто да се повиши температурата и да се ускори изпаряването. По-подходящ подход е да се намали температурата на изпаряване, като се минимизира времето на престой.

Изпарител с размазваща филмова конструкция работи под вакуум и непрекъснато обновява течния филм върху загрятата повърхност. Това подобрява топлопреминаването и позволява летливите разтворители да изпаряват бързо при сравнително меки условия, намалявайки времето, през което пептидите остават в загрятата зона.

Предизвикателство 3: Потреблението на ацетонитрил поражда силна необходимост от възстановяване на разтворителя

Ацетонитрилът се използва широко като органичен подвижен фазов разтворител в подготовката на пептиди чрез ВЕВХ. При увеличаване на мащаба на производството от лабораторно до пилотно и промишлено ниво консумацията на ацетонитрил може значително да нарасне.

Ако всички смеси от ацетонитрил и вода се третират директно като отпадъчна течност, както консумацията на разтворител, така и натоварването върху системите за отпадъчна обработка се увеличават.

За подходящи процеси може да се разгледа комбиниран маршрут:

Изпаряване с триещ се филм → Кондензация → Рекуперация на разтворителя → Вакуумна дестилация

Изпарителят с триещ се филм първо отделя летливите компоненти, като ацетонитрил и вода, от разтвора, съдържащ пептиди. Полученият пара след това се кондензира и събира.

Ако е необходим по-висок процент чистота на ацетонитрила, рекуперираната разтворителна смес може да бъде допълнително обработена в колона за дестилация.

Тази конфигурация запазва целевия пептид далеч от продължителни дестилационни условия, докато позволява на дестилационната система да изпълнява задачата, за която е по-подходяща: отделяне и почистване на разтворителя.

Предизвикателство 4: Процесите за пептиди не могат просто да копират един и същ набор от параметри

Различните пептиди могат значително да се различават по молекулна маса, последователност, начална концентрация, състав на разтворителя, вискозитет, склонност към пенене, кристализационно поведение и термична чувствителност.

Поради тази причина един фиксиран набор от температура, вакуум, скорост на подаване и съотношение на концентрация не може да се прилага за всяка пептидна система.

За материали с висока стойност по-надежден подход за мащабиране е:

Тестване на материала → Потвърждаване на параметрите → Мащабиране на пилотна инсталация → Проектиране на производствено оборудване

Тестването може да се използва за оценка на фактори като състав на подавания материал, съотношение ацетонитрил/вода, капацитет на обработка, максимално допустима температура, целево съотношение на концентрация, ниво на вакуум, скорост на подаване и работни условия за скребера.

Това помага да се определи стабилен работен диапазон преди преминаване към по-голяма система.

2. Подходът на YHCHEM за постобработка на пептиди

В типичния процес за преработка на пептиди изпарителят с ротационен филм се монтира след ВЕВХ-очистване, за да се обработват големи обеми фракции с ниска концентрация.

Основната му задача е бързото отстраняване на разтворител и предварително концентриране под вакуум чрез образуване на тънък филм и кратко време на престой, което намалява термичното въздействие.

Кондензираната смес от ацетонитрил и вода може след това да се подава към дестилационна система, когато е необходимо допълнително очистване или възстановяване на разтворителя.

За определени специални системи, съдържащи високовриещи, термолабилни и достатъчно летливи органични компоненти, може да се оцени и молекулярна дестилация, според действителните физични свойства на материала.

Обаче повечето пептиди имат относително висока молекулна маса и изключително ниска летливост. Следователно молекулярната дестилация обикновено не се използва като основен метод за директно очистване на целевия пептид.

Ключовото е не просто да се свържат последователно молекулярната дестилация, изпаряването с изтрита филмова повърхност и дестилационното оборудване. Всяка единична операция трябва да извършва задачата по разделяне, която най-добре отговаря на нейните характеристики.

3. Защо да се използва изпаряване с изтрита филмова повърхност за концентриране на пептиди?

За отстраняване на разтворител могат да се използват няколко типа оборудване, включително ротационни изпарители, обикновени партидни вакуумни изпарители и изпарители с изтрита филмова повърхност.

Ротационни евапоратори

Ротационните изпарители са гъвкави и удобни за малки лабораторни партиди. При увеличаване на обема на преработката обаче капацитетът на партидата, времето за преработка, непрекъснатостта и ефективността на възстановяването на разтворителя могат да станат ограничаващи фактори.

Партидни вакуумни изпарители

Партидното вакуумно изпаряване може да обработва по-големи обеми, но цялата партида остава в съда по време на нагряване и концентриране. За термолабилни и високостойностни пептидни материали продължителното топлинно въздействие трябва да се контролира внимателно.

Изпарители с изтриватели

В изпарител с изтрита пленка материала непрекъснато се разпределя в тънка пленка по повърхността за изпаряване. В комбинация с вакуумна работа това осигурява бързо топлопреминаване и изпаряване на разтворителя.

Основните му предимства за концентриране на пептиди включват:

Изпаряване при по-ниска температура
Вакуумът намалява температурата на кипене на ацетонитрила, водата и други летливи разтворители, което позволява концентриране при по-меки условия.

Кратко време на престой
Материалът бързо преминава през зоната за изпаряване, вместо да остава продължително време в нагрята партида.

Ефективен пренос на топлина
Чистачът непрекъснато обновява течната пленка, намалявайки съпротивлението при топлопреминаване и подобрявайки ефективността на изпаряването.

Непрекъснато procession
Непрекъснатото подаване и отвеждане улесняват интегрирането на изпарителя с горния HPLC фракционен колектор и с долните стъпки – кондензация, възстановяване на разтворителя и лиофилизиране.

Удобно събиране на разтворителя
Отстраненият ацетонитрил и вода могат да се кондензират и съберат за последваща сепарация и възстановяване.

4. Мащабирането е нещо повече от просто увеличаване на размера на оборудването

Преходът от лабораторни експерименти в грамов мащаб към производство на пептиди в килограмов мащаб или по-голямо не е просто въпрос на увеличаване на обема на съда.

Самият процес трябва да бъде мащабиран.

Ключови параметри включват време на престой, площ за топлообмен, стабилност на вакуума, капацитет за кондензация, скорост на подаване, съотношение на концентрация и контрол на крайната точка.

Ротационен изпарител може да работи добре за малка лабораторна партида, но когато обемът на течността се увеличи до десетки или стотици литри, времето за обработка, топлинната история и изискванията за възстановяване на разтворителя могат значително да се променят.

За високостойностни пептидни материали оборудването следователно трябва да бъде проектирано според изискванията към материала и процеса, а не обратното – да се принуждава материала да се адаптира към фиксирана конфигурация на оборудването.

YHCHEM се фокусира върху пълния процес на разработка – от изпитване на материали и верификация на параметрите на процеса до пилотно мащабиране и проектиране на непрекъснато оборудване. Площта за изпаряване, вакуумната система, капацитетът на кондензатора, конфигурацията на оборудването и автоматизацията могат да бъдат избрани според действителните изисквания към процеса.

5. Пример за приложение: Концентриране на фракции от чистене на пептиди

Една компания в източна част на Китай мащабираше процес за получаване на пептиди, базиран на твърдофазен синтез и подготовка чрез ВЕВХ хроматография.

С увеличаването на обема на партията обемът на HPLC-фракциите, съдържащи пептиди, също се увеличи значително. Тези фракции съдържаха големи количества вода и ацетонитрил, докато концентрацията на пептида оставаше относително ниска.

Компанията преди това е използвала конвенционално пакетно изпаряване за предварителна концентрация. При увеличаване на производствената мощност обаче процесът срещна по-дълги времена за концентрация, по-голямо термично въздействие и по-високо натоварване върху лиофилизатора. Възстановената смес от ацетонитрил/вода също нямаше ефективен маршрут за възстановяване.

Въз основа на анализ на материала и предварителни процесни изпитвания долното течение на процеса беше коригирано по следния начин:

HPLC Пуритификация → Изпаряване с размазваща филмова глава → Концентрат на пептиди → Лиофилизация

По време на изпаряването с размазваща филмова глава вакуумът намалява температурата на изпаряване на разтворителя. Храната се бързо разпределя в тънка филмова пелена, което позволява ацетонитрилът и част от водата да се отстранят в сравнително кратко време на престой, докато пептидите остават предимно в концентрираната тежка фаза.

Изпареният разтворител се кондензира и събира. При нужда може да се използва допълнителна система за вакуумна дестилация, за да се осъществи по-нататъшно разделяне на възстановената смес от ацетонитрил/вода.

Този процес прехвърля значителна част от задачата по отстраняване на разтворителя от замразяващия сушилня към изпарителя с изтрита филмова повърхност, намалявайки обема на течността, която влиза в стадията на замразяващо сушене, и подобрявайки общата непрекъснатост на процеса.

Полученият процес може да се резюмира като:

Изпарение с изтрита филмова повърхност за концентриране на пептиди при ниски температури + Дестилация за възстановяване на разтворителя + Замразяващо сушене за окончателна подготовка на продукта

Всяка единична операция изпълнява различна функция, което помага да се намали ненужното термично въздействие и осигурява практически основи за по-нататъшно мащабиране.

Забележка: Този пример е базиран на типичен сценарий за долното преработване на пептиди. Фактическата конфигурация на оборудването и работните параметри трябва да се определят според състава на материала, капацитета за преработка, характеристиките на продукта и експерименталните резултати.