Tärkeä askel peptidisynteesin jälkeen: pitoisuuden lisääminen, liuotteen poisto ja liuotteen talteenotto

Viime vuosina peptidilääkkeiden, funktionaalisten peptidien, kosmetiikkateollisuuden aktiivipeptidien ja peptidivälituotteiden kehitys ja teollistuminen ovat kiihtyneet merkittävästi. Vertailussa perinteisiin pienimolekyylisiin yhdisteisiin peptidit ovat yleensä monimutkaisempia rakenteeltaan, niillä on korkeampi molekyylimassa ja ne ovat herkempiä lämmölle. Kun peptidituotanto siirtyy laboratoriotutkimuksesta kokeilu- ja teolliseen mittakaavaan, alapuolinen prosessointi saa yhä suuremman merkityksen.

Peptidisynteesi on vain ensimmäinen askel. Puhdistus, pitoisuuden lisääminen, liuotteen poistaminen, liuotteen talteenotto ja kuivatus voivat vaikuttaa suoraan tuotteen laatuun, saantoon, käyttötehokkuuteen ja tuotantokustannuksiin.

 

Kiinteäfaasiseen peptidisynteesiin (SPPS) perustuvien peptidien valmistuksessa, erityisesti preparatiivisen HPLC-puhdistuksen jälkeen, syntyy usein suuria määriä alhaisen pitoisuuden fraktioita. Tämän vuoksi asetonitriilin, veden ja muiden liuottimien tehokas poistaminen lämpökuormitusta minimoimalla on keskeinen haaste peptidien skaalautumisessa.

1. Mikä tekee peptidien jälkikäsittelyn vaikeaksi?

Tyypillinen SPPS-prosessi sisältää deprotektion, kytkennän, pesun, irrottamisen, suodatuksen, raakatuotteen käsittelyn, HPLC-puhdistuksen, pitoisuuden lisäämisen ja jäädytyskuivauksen.

Preparatiivisen HPLC:n jälkeen kerätyt fraktiot eivät kuitenkaan ole pelkästään ”peptidiliuoksia”. Ne sisältävät yleensä suuria määriä vettä ja asetonitriiliä, joskus pieniä määriä happamia muokkausaineita, kun taas kohdepeptidin pitoisuus pysyy suhteellisen alhaisena.

Tämä aiheuttaa useita yleisiä käsittelyhaasteita.

Haaste 1: Suuret HPLC-fraktiomäärät lisäävät jäädytyskuivauskuormaa

Valmisteluvaiheessa käytetään yleisesti HPLC:ta, jossa liuottimina käytetään vettä ja asetonitriiliä gradientti-eluoitnissa. Kohdepeptidi voidaan kerätä useisiin eri fraktioihin, mikä johtaa suureen kokonaismäiseen nestemäiseen tilavuuteen suhteellisen alhaisella peptidipitoisuudella.

Jos nämä fraktiot lähetetään suoraan pakastekuivuriin, jäähtelyn ja sublimoinnin kuorma kasvaa merkittävästi. Tämä voi pidentää pakastekuivatuskierrosta ja varata arvokasta laitteistokapasiteettia.

Käytännöllinen ratkaisu on lisätä pakastekuivauksen eteen pyyhkäisykalvoevaporointivaihe.

Alhaisen paineen alaisena liuottimien kiehumispiste laskee. Syöttöaine jaetaan jatkuvasti pyyhkäisyjärjestelmän avulla ohueksi kalvoksi, mikä mahdollistaa asetonitriilin ja osan vedestä nopean haihtumisen, kun taas peptidi pysyy pääosin konsentroituneessa nestefasissa.

Tämä vähentää nestemäisen tilavuuden määrää, joka pääsee pakastekuivuriin, ja siirtää osan liuottimen poistamisesta tehokkaampaan esikonsentrointivaiheeseen.

Haaste 2: Peptidit ovat lämpöherkkiä

Jotkut peptidit ovat herkkiä lämpötilalle, pH:lle ja hapettumisolosuhteille. Perinteisessä erityksellisessä höyrystysmenetelmässä aine saattaa pysyä kuumennetussa astiassa pitkän aikaa.

Kun pitoisuus kasvaa, myös viskositeetti ja paikallinen pitoisuus voivat nousta. Pituudeltaan pidetty kuumennus voi lisätä peptidien hajoamisen, aggregoitumisen, värin muuttumisen tai aktiivisuuden menetyksen riskiä.

Peptidien pitoisuuden lisäämisessä tavoitteena ei siksi ole pelkästään lämpötilan nostaminen ja höyrystymisen nopeuttaminen. Sovituimpiin menetelmiin kuuluu höyrystyslämpötilan alentaminen samalla kun aineen oleskeluaika minimoituu.

Pyöriväkalvohöyrystin toimii alipaineessa ja uudistaa nestekalvon jatkuvasti lämmitetyllä pinnalla. Tämä parantaa lämmön siirtymistä ja mahdollistaa haihtuvien liuottimien nopean höyrystymisen suhteellisen lievissä olosuhteissa, mikä vähentää peptidin oleskeluaikaa kuumennetulla alueella.

Haaste 3: Asetonitriilin kulutus aiheuttaa voimakkaan tarpeen liuottimen talteenottoon

Acetonitriiliä käytetään laajalti orgaanisena liuottimenä valmistelevässä peptidien HPLC-erottelussa. Kun tuotannon mittakaava kasvaa laboratoriotasolta kokeilu- ja teolliseen tuotantotasoon, acetonitriilin kulutus voi kasvaa huomattavasti.

Jos kaikki acetonitriili/vesi-seokset käsitellään suoraan jätteeksi, sekä liuottimen kulutus että jäteveden käsittelyn rasitus kasvavat.

Sopiville prosesseille voidaan harkita yhdistettyä reittiä:

Pyöriväkalvohöyrystys → Kondensointi → Liuottimen talteenotto → Tyhjiöhöyrystys

Pyöriväkalvohöyrystin poistaa ensin haihtuvia komponentteja, kuten acetonitriiliä ja vettä, peptidipitoisesta liuoksesta. Höyry kondensoituu ja kerätään.

Jos vaaditaan korkeampaa acetonitriilin puhdastasoa, talteenotettua liuottimiseosta voidaan käsitellä lisää tislauspylväässä.

Tämä konfiguraatio pitää kohdemolekyylin (peptidin) poissa pitkäkestoisista tislausolosuhteista samalla kun tislausjärjestelmä suorittaa siihen paremmin soveltuvan tehtävän: liuottimen erottelun ja puhdistuksen.

Haaste 4: Peptidiprosessit eivät voi yksinkertaisesti kopioida yhtä parametrijoukkoa

Eri peptidit voivat vaihdella merkittävästi molekyylimassassa, sekvenssissä, alkukonsentraatiossa, liuotteen koostumuksessa, viskositeetissa, kuplantumisalttiudessa, kiteytymiskäyttäytymisessä ja lämpöherkkyydessä.

Tästä syystä yhtä kiinteää lämpötilan, tyhjiön, syöttönopeuden ja pitoisuussuhteen yhdistelmää ei voida soveltaa kaikkiin peptidijärjestelmiin.

Korkean arvon materiaaleille luotettavampi skaalautumisreitti on:

Materiaalin testaus → Parametrien varmistus → Pilottiskaalautuminen → Tuotantolaitteiston suunnittelu

Testauksella voidaan arvioida tekijöitä, kuten syöttöliuoksen koostumusta, asetonitriili/vesi -suhdetta, käsittelykapasiteettia, enimmäiskäyttösallittua lämpötilaa, tavoiteltavaa pitoisuussuhdetta, tyhjiötasoa, syöttönopeutta ja pyyhkijän toimintaehtoja.

Tämä auttaa vakiinnuttamaan vakaa käyttöalue ennen siirtymistä suurempaan järjestelmään.

2. YHCHEMin lähestymistapa peptidien jälkikäsittelyyn

Tyypillisessä peptidien jälkikäsittelyprosessissa pyyhkäisykalvohöyrystin asennetaan HPLC-puhdistuksen jälkeen käsittelämään suuria määriä alhaisen pitoisuuden fraktioita.

Sen ensisijainen tehtävä on nopea liuotteen poisto ja esikonsentrointi tyhjiössä, jossa käytetään ohutta kalvoa ja lyhyttä resideenssiaikaansa vähentääksesi lämmöllistä altistumista.

Tiukentunut asetonitriili/vesiseos voidaan sen jälkeen lähettää tislausjärjestelmään, kun lisäliuotteen puhdistusta tai talteenottoa vaaditaan.

Tietyissä erityisjärjestelmissä, jotka sisältävät korkean kiehumispisteen, lämpöherkkiä ja riittävän haihtuvia orgaanisia komponentteja, molekulaarista tislausta voidaan myös arvioida materiaalin todellisten fysikaalisten ominaisuuksien perusteella.

Useimmat peptidit itse ovat kuitenkin suhteellisen suurimolekyylisiä ja äärimmäisen vähän haihtuvia. Molekulaarista tislausta ei siksi yleensä käytetä ensisijaisena menetelmänä kohdepeptidin suoraa puhdistusta varten.

Avaimena ei ole pelkästään molekulaarisen tislaamisen, pyyhkäisykalvohöyrystyksen ja tislauslaitteiston kytkeminen peräkkäin. Jokaisen yksikkötoiminnon tulisi suorittaa erottelutehtävä, joka sopii parhaiten sen ominaisuuksiin.

3. Miksi käyttää pyyhkäisykalvohöyrystystä peptidien pitoisuuden lisäämiseen?

Liukemittaren poistoon voidaan käyttää useita eri laitteita, kuten kiertohöyrystimiä, perinteisiä eräperäisiä tyhjiöhöyrystimiä ja pyyhkäisykalvohöyrystimiä.

Pyörivät evaporaattorit

Kiertohöyrystimet ovat joustavia ja käteviä pienille laboratoriolaitoksille. Kuitenkin, kun käsittelymäärä kasvaa, erän kapasiteetti, käsittelyaika, jatkuvuus ja liukemittarin talteenottotehokkuus voivat muodostua rajoittaviksi tekijöiksi.

Eräperäiset tyhjiöhöyrystimet

Eräperäinen tyhjiöhöyrystys voi käsittää suurempia määriä, mutta koko erä pysyy säiliössä koko lämmitys- ja pitoisuuden lisäysprosessin ajan. Lämpöherkillä ja korkean arvon omaavilla peptidimateriaaleilla pitkäaikainen lämpöaltistus vaatii huolellista säätöä.

Wipefilmevaporatorit

Kiehutuslevyssä materiaali jakautuu jatkuvasti ohueksi kalvoksi kiehutuspinnalle. Yhdistettynä tyhjiötoimintoon tämä mahdollistaa nopean lämmön siirtymisen ja liuotteen haihtumisen.

Sen tärkeimmät edut peptidien pitoisuuden lisäämisessä ovat:

Alhaisemman lämpötilan kiehuminen
Tyhjiö alentaa asetoniitrilin, veden ja muiden haihtuvien liuottimien kiehumispistettä, mikä mahdollistaa pitoisuuden lisäämisen lempeämmillä olosuhteilla.

Lyhyt viibiomisaika
Materiaali kulkee nopeasti kiehutusalueen läpi eikä pysy kuumennetussa eräkäsittelemisastialla pitkään.

Tehokas lämmönsiirto
Pyörivä harja uusii nestekalvoa jatkuvasti, mikä vähentää lämmönsiirtovastusta ja parantaa haihtumistehokkuutta.

Jatkuva käsittely
Jatkuva syöttö ja poisto tekevät haihduttimen integroinnista helpompaa sekä ylävirtaan sijaitsevan HPLC-jakajan että alavirtaan sijaitsevan kondensaattorin, liuotteen talteenoton ja jäädytyskuivauksen kanssa.

Kätevä liuotteen keruu
Poistettu asetoniitrili ja vesi voidaan tiukentaa ja kerätä lisäerottelua ja talteenottoa varten.

4. Mittakaavan suurentaminen tarkoittaa enemmän kuin vain laitteiston koon kasvattamista

Siirtyminen gramma-asteikollisista laboratorikokeista kilogramma-asteikolliseen tai suurempaan peptidituotantoon ei ole pelkästään astian koon lisäämistä.

Itse prosessi on skaalattava.

Tärkeitä parametrejä ovat pidätysaika, lämmönsiirtoala, tyhjiön vakaus, kondensaatiokyky, syöttönopeus, pitoisuussuhde ja lopetuskontrolli.

Pyörivä haihdutin voi toimia hyvin pienelle laboratorioerälle, mutta kun nestemäisen aineen määrä kasvaa kymmeniin tai satoihin litroihin, käsittelyaika, lämpöhistoria ja liuotinpalautusvaatimukset voivat muuttua merkittävästi.

Korkean arvon omaavien peptidimateriaalien osalta laitteiston tulisi siksi suunnitella materiaalin ja prosessivaatimusten perusteella eikä pakottaa materiaalia sopeutumaan kiinteään laitteistokonfiguraatioon.

YHCHEM keskittyy koko kehityspolkuun materiaalitestauksesta ja prosessiparametrien vahvistuksesta pilot-tasoiselle laajentamiselle ja jatkuvalle laitteiston suunnittelulle. Haihdutusala, tyhjiöjärjestelmä, kondensaattorin kapasiteetti, laitteiston konfiguraatio ja automaatio voidaan valita sitten todellisten prosessivaatimusten mukaan.

5. Sovellusesimerkki: Peptidipuhdistusfraktioiden pitoisuuden lisääminen

Itä-Kiinassa sijaitseva yritys laajensi peptidiprosessiaan kiinteäfaasisyntheseesi ja valmistavaan HPLC-puhdistukseen perustuen.

Erän koon kasvaessa peptidia sisältävien HPLC-fraktioiden tilavuus kasvoi merkittävästi. Nämä fraktiot sisälsivät suuria määriä vettä ja asetonitriiliä, kun taas peptidipitoisuus pysyi suhteellisen alhaisena.

Yritys oli aiemmin käyttänyt perinteistä eräevaporointia esikonsentrointiin. Kuitenkin kasvavan käsittelykapasiteetin myötä prosessi kohtasi pidempiä konsentrointiaikojen, lisääntyneen lämpökuorman ja suuremman jääkuivatuskuorman. Myös talteen saatua asetonitriili/vesi-seosta ei ollut tehokasta tapaa hyödyntää.

Aineanalyysejä ja alustavia prosessikokeita perustuen alaprosessia muokattiin seuraavasti:

HPLC-puhdistus → pyyhkäisykalvoparantaminen → peptidikonsentraatti → jääkuivatus

Pyyhkäisykalvoparantamisen aikana alhainen paine laskee liuotteen haihtumislämpötilaa. Syöttöaine jakautuu nopeasti ohueksi kalvoksi, mikä mahdollistaa asetonitriilin ja osan vedestä poistamisen suhteellisen lyhyessä aikassa, kun peptidi pysyy pääosin konsentroituneessa raskaassa vaiheessa.

Haihtunut liuote tiukenee ja kerätään. Tarvittaessa lisäpainevirtausdestillaatiojärjestelmää voidaan käyttää edelleen talteen saadun asetonitriili/vesi-seoksen erottamiseen.

Tämä prosessi siirtää merkittävän osan liuotteen poistamisesta jääkuivaimelta pyyhkäisykalvohöyrystimelle, mikä vähentää nestemäisen tilavuuden määrää, joka saapuu jääkuivausvaiheeseen, ja parantaa kokonaisprosessin jatkuvuutta.

Saatu prosessi voidaan tiivistää seuraavasti:

Pyyhkäisykalvohöyrystys alhaisessa lämpötilassa peptidien pitoisuuden kasvattamiseksi + tislaus liuottimen talteenottamiseksi + jääkuivaus lopputuotteen valmistukseen

Jokainen yksikkötoiminto suorittaa eri tehtävän, mikä auttaa vähentämään tarpeetonta kuumennusta ja tarjoaa käytännöllisen perustan lisälaajentamiselle.

Huomautus: Tämä esimerkki perustuu edustavaan peptidien jälkikäsittelyyn liittyvään skenaarioon. Todellinen laitteiston konfiguraatio ja käyttöparametrit on määritettävä materiaalin koostumuksen, käsittelykapasiteetin, tuotteen ominaisuuksien ja kokeellisten tulosten perusteella.