पेप्टाइड शोधन

विशिष्ट ऐमिनो एसिड क्रमांकों वाले पेप्टाइड्स को प्राप्त करने के लिए, हम Fmoc-SPPS (सॉलिड-फ़ेज पेप्टाइड सिंथेसिस) विधि का उपयोग करते हैं।

पृष्ठभूमि:

पेप्टाइड जीवाणुओं में विभिन्न कोशिकाओं के कार्यों से संबंधित जीवनशील पदार्थ हैं। उनकी आणविक संरचना ऐमिनो एसिड्स और प्रोटीन के बीच होती है, जिसमें विशिष्ट क्रम में कई ऐमिनो एसिड्स होते हैं और उन्हें पेप्टाइड बांड (—NH—CO—) द्वारा जोड़ा जाता है। दो ऐमिनो एसिड मॉलेक्यूल्स के वाष्पन संक्षारण द्वारा बने यौगिक को डायपेप्टाइड कहा जाता है, इसी तरह तीन, चार, पांच और अन्य तक नौ तक के पेप्टाइड होते हैं। सामान्यतः 10 से 100 ऐमिनो एसिड मॉलेक्यूल्स के वाष्पन संक्षारण से बने यौगिक को पॉलीपेप्टाइड कहा जाता है।

पेप्टाइड कस्टम सेवाएं ग्राहक की मांगों जैसे क्रम, शुद्धता, आणविक भार और नमक की मात्रा पर आधारित पेप्टाइड के संश्लेषण को संदर्भित करती हैं, ताकि विशिष्ट जरूरतों को पूरा किया जा सके। आणविक भार को मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पुष्ट किया जाता है ताकि खूबसूरती MS की सही जाँच हो, फिर उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग शुद्धीकरण के लिए किया जाता है, फिर सांद्रण और बर्फीले शुष्क करने से अच्छा पेप्टाइड चूर्ण प्राप्त होता है।

विशिष्ट ऐमिनो एसिड क्रम वाले पेप्टाइड प्राप्त करने के लिए, हम Fmoc-SPPS (ठोस-फ़ेज पेप्टाइड संश्लेषण) विधि का उपयोग करते हैं। ठोस-फ़ेज संश्लेषण के दौरान, ठोस-फ़ेज कार्यकर्ता पर कार्बॉक्सिल समूहों के साथ क्रियाशील होने वाला समूह जोड़ा जाता है, जो ऐमिनो-संरक्षित ऐमिनो के साथ क्रिया करता है, पहले ऐमिनो एसिड को रेजिन पर बांधता है। फिर C-अंत से N-अंत तक क्रिया पूरी करके लक्षित पेप्टाइड क्रम का संश्लेषण पूरा करते हैं।

शुद्धीकरण विधियां:

हमारी कंपनी वियोजन और शुद्धिकरण के लिए प्रतिगामी C18 तैयारी खंभे वाले उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करती है, इस प्रक्रिया को निम्नलिखित चरणों के अनुसार जारी रखती है:

पहचान: क्रूड पेपटाइड की छोटी मात्रा को मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए लें ताकि लक्ष्य पेपटाइड की उपस्थिति की पुष्टि हो (अगर हाँ, तो विश्लेषणात्मक क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से C18 खंभे में इसके रिटेंशन समय की पुष्टि करें; अगर नहीं, तो क्रूड पेपटाइड को पुन: संश्लेषित करें).

विलयन: विलयन के लिए अल्ट्रासोनिक सहायता का उपयोग करें, आमतौर पर 90% पानी + 10% एसिटोनाइट्राइल (मेथेनॉल या आइसोप्रोपेनॉल) का चयन करें। यदि विलेयता कठिन है, तो अगर अनुक्रम में बुनियादी ऐमिनो अम्लों का अधिक अनुपात है, तो विलयन की सहायता के लिए उपयुक्त एसिटिक एसिड या ट्रिफ्लुओरोएसिटिक एसिड जोड़ें; यदि अम्लीय ऐमिनो अम्ल प्रमुख हैं, तो उपयुक्त अमोनिया पानी जोड़ें। यदि हाइड्रोफोबिक ऐमिनो अम्ल प्रमुख हैं, तो DMSO (डाइमेथाइल सल्फोक्साइड) का उपयोग करें।

निस्पंदन: विलीन क्रूड उत्पाद को बाद में उपयोग के लिए 0.45 µm फिल्टर मेम्ब्रेन से फिल्टर करें (तैयारी खंभे की सुरक्षा के लिए).

नमूना लोडिंग: उच्च-प्रदर्शन तरल पूर्वग्रहण प्रणाली का उपयोग करें ताकि तरल नमूना पूर्वग्रहण स्तंभ में डाला जा सके।

अलग करना (Elution): चरण 1) में निर्धारित अलग करने के ग्रेडिएंट के आधार पर, विभिन्न लंबाई के पेप्टाइड के ध्रुवता के अंतर का उपयोग करके अशुद्धियों को पेप्टाइड से अलग करें।

उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करने के फायदे:

अन्य क्रोमेटोग्राफी विधियों की तुलना में अधिक विशिष्टता; उपयोग किए गए C18 पूर्वग्रहण स्तंभ में उच्च स्तंभ कार्यक्षमता, लंबा सेवा जीवन, और अच्छी पुनरावृत्ति होती है, जिससे बार-बार उपयोग किया जा सकता है; तेज गति और उच्च कार्यक्षमता, प्रत्येक नमूने को सफ़ेद करने में कुछ मिनट या दस ही मिनट लगते हैं; विपरीत-फаз क्रोमेटोग्राफी का चওंदा अनुप्रयोग और परिपक्व प्रौद्योगिकी, जो विभिन्न प्रकार के यौगिकों के लिए अच्छी चयनक्षमता प्रदान करती है।

कच्चे पेप्टाइड को सफ़ेद करने और लाइओफ़ाइलाइज़ करना:

क्रूड पेप्टाइड को उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी प्रीपैरेटरी सिस्टम का उपयोग करके अलग किया जाता है और शुद्धता की जाँच करने के लिए उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफ़ (एचपीएलसी) का उपयोग किया जाता है ताकि योग्य तरल घटक प्राप्त हों।

रोटरी वापर करण प्रणाली: योग्य तरल घटक को रिक्त स्थान गर्मी के लिए उपयोग किया जाता है ताकि आसानी से वाष्पशील कार्बनिक सॉल्वेंट को दूर किया जा सके, अंततः लक्ष्य पेप्टाइड युक्त एक घोल प्राप्त होता है, जिसे फिर फ्रीज़र में रखा जाता है ताकि ठोस बर्फ के क्रिस्टल बनें।

फ्रीज-ड्राइंग प्रणाली: ठोस बर्फ के क्रिस्टल युक्त कंटेनर को फ्रीज-ड्राइअर ट्रे या रिक्त स्थान पोर्ट पर रखा जाता है। रिक्त स्थान परिवेश में, पेप्टाइड उत्पाद को उपघटित किया जाता है, अंततः ठोस पेप्टाइड पाउडर प्राप्त होता है।

पेप्टाइड क्रिस्टल फ्रीज-ड्राइअर में फ्रीज-ड्राइंग के लिए तैयार है।